بافت چرب و لزج و رسوب دار

مشکل : بافت چرب و لزج و رسوب دار

معمولا علت اصلی بلوک هایی با این ویژگی ها ، چربی است. پردازش و آماده سازی بافت در حذف لیپید از نواحی مختلف نمونه ناکام مانده است و  پارافین به درستی در بخش های مختلف بافت نفوذ نکرده است به همین دلیل بافت برای برش بخوبی پشتیبانی نمی شود.

این امر معمولاً در نمونه های بزرگ پستان دیده می شود. نمونه هایی که با استفاده از یک چرخه به مدت خیلی کوتاه پردازش شده اند برای پردازش مجدد باید توسط یک چرخه طولانی تر پردازش شوند. (از راهکارهای 9 یا 10 استفاده کنید)

مثال

شکل زیر یک نمونه پستان چرب که کم تر از حد مطلوب پردازش شده است با یک ناحیه مرکزی وسیع که چرب مانده است را نشان می دهد.

فقط یک سکشن نازک از بافت برش خورده می تواند به لام منتقل شود (شکل زیر). بافت نه به درستی آبگیری شده و نه شفاف سازی شده است(حاوی چربی حل نشده) و باید دوباره پردازش شود. راه حل 9 با استفاده از یک چرخه هشت ساعته پیشنهاد می شود.

 

 

 

راه حل 9: برای نمونه های کاملا فیکس شده اما پردازش ناقص

هر یک از این روش ها شامل استفاده از دستگاه تیشوپروسسور نیز می باشد. پس بسیار دقت کنید که هرگونه مشکل و خطا در دستگاه را رفع و اصلاح کنید و پیش از شروع پروسه محلول های آلوده و استفاده شده را تعویض و بخوبی و متناسب با نوع بافت جایگزین کنید. اگر پردازش مجدد به درستی انجام شود باید بتوان برش های مناسبی از بافت تهیه کرد بطوریکه قبل از پردازش مجدد امکان پذیر نبود. هرچند نتایج بخوبی شرایطی که اگر پردازش اولیه بهینه انجام میشد بدست می آمد نخواهد بود اما به نسبت می توان نتیجه ی مطلوب تری کسب کرد.

راه حل 9a : پردازش مجددا با استفاده از سرم نمکی (روش Taggart19)

توجه:

در این روش موم اضافی قبل از پردازش مجدد با نمک داغ برداشته می شود. محلول نمکی به آرامی بافت را هیدراته می کند و سپس به طور معمول پردازش می شود. سالین یک معرف غیر سمی است که می تواند با اطمینان در آزمایشگاه های مورد استفاده قرار گیرد.

• پیش از پردازش مجدد ، هر بلوک را ذوب کرده و به آرامی پارافین اضافه را از آنها پاک کنید سپس نمونه را در کاست جدید با برچسب قرار دهید. این کار امکان نفوذ معرف ها به نمونه در پردازش مجدد را تسهیل میکند
• کاست ها را در لیوان isotonic saline (محلول آبی 0.9٪ کلرید سدیم) به مدت 1 ساعت در دمای 65 درجه سانتی گراد در دستگاه انکوباتور قرار دهید( 1 ساعت برای طیف وسیعی از انواع نمونه ها و ابعاد مختلف کارآمد است ). اینکار باعث ذوب پارافین و قرار گرفتن پارافین روی سطح saline می شود.
• کاست ها را از محلول خارج کنید و بطور مختصر تخلیه کنید و در پروسسور قرار دهید و با استفاده از یک برنامه با استفاده از فرمالین مجددا پردازش کنید. مدت زمان پردازش به اندازه و ماهیت نمونه بستگی دارد.

میکروگرافهای شکل زیر نشان می دهد که با پردازش مجدد با استفاده از روش 9a (روش Taggart) می توان به چه نتایجی دست یافت. این حجم نمونه ی چربی زیر پوستی بطور معمول به یک برنامه ی 8 ساعته برای پردازش بهینه نیاز دارد.اما عمدا تحت یک چرخه ی ناکافی 2 ساعته پردازش داده شده است. میکروگراف A بهترین برشی را که پس از این پردازش ناکافی می توان بدست آورد را نشان می دهد. میکروگراف B پس از پردازش مجدد با استفاده از سرم نمکی saline برای حذف پارافین و آبگیری بافت نمونه، همانطور که در بالا توضیح داده شد توسط یک چرخه 8 ساعته پردازش شده است سپس دوباره برش داده شده است. اگرچه برش بدست آمده از این روش منسجم است و از استاندارد قابل قبول بهره مند است اما اگر در وهله اول از برنامه صحیح استفاده می شد بطبع نتیجه ی بهتری ، محقق می شد.

 

راه حل 9b: پردازش مجدد با استفاده از چرخه شفاف سازی تیشوپروسسور یا تغییرات آن.

توجه!

این یک روش مناسب با استفاده از معرف های شفاف سازی است که پارافین  را از سطح بافت پاک می کنند و بافت را به مرحله ی الکل باز میگرداند. این روش نسبت به روش های 9a یا 9c بصورت بالقوه خشن تر است.

• پیش از پردازش مجدد پارافین را ذوب کنید پارافین اضافی را به آرامی از هر بلوک پاک کنید. این کار نفوذ معرف های پردازش را به سطح بافت در طول پروسه راحت تر می کند.
• تیشو کاست ها را در داخل بسکت قرار داده سپس داخل پروسسور بگذارید.
• چرخه پردازش (شفاف سازی ) را که از معرف های شفاف کننده استفاده می کند در تیشوپروسسور اجرا کنید.(به جدول 2 مراجعه کنید).در پروسه استفاده از گزیلل را به Waxsol ترجیح دهید زیرا نسبت به waxsol ملایم تر عمل می کند. این کار نمونه ها را توسط گزیلل و چندین مورد تعویض الکل دوباره بازسازی میکند. اما توجه داشته باشید که نباید بافت وارد فاز خشک شدن که ممکن است بخشی از چرخه ی شفاف سازی باشد، شود. برنامه باید پیش از رسیدن به این مرحله متوقف شود. به همین دلیل بارگذاری برنامه ی جدید مانند برنامه ی زیر، در دستگاه منطقی تر است.
• از فرمالین و الکل در یک برنامه ی زمانی دقیق که در آغاز فرآیند برای نمونه مناسب بود استفاده کنید. این میزان به ماهیت نمونه و اندازه ی آن بستگی دارد. اگر نمونه را در فرمالین نگه دارید و با نمونه های بعدی باهم پردازش کنید راحت تر خواهد بود.

 

میکروگرافهای شکل زیر نشان می دهد که با پردازش مجدد با استفاده از روش 9b (معرفهای چرخه شفاف سازی) می توان به چه نتیجه ای دست یافت.

این حجم نمونه چربی بطور معمول به یک چرخه ی پردازش 8 ساعته برای پردازش بهینه نیاز دارد. اما عمدا تحت یک چرخه ی ناکافی 2 ساعته پردازش شده است. تصویر زیر بهترین برشی را نشان می دهد که می توان پس از این چرخه ی 2 ساعته بدست آورد. تصویر زیر نیز پس از پردازش مجدد که با استفاده از یک چرخه شفاف سازی کوتاه بازسازی شده است گرفته شده است. که بدنبال چرخه ی 8 ساعته مجددا نمونه به آرامی برش داده شده است.

 

راه حل 9c : پردازش مجدد مستقیم

توجه:

این روش پیش از پردازش مجدد به هیچگونه پیش سازی نیاز ندارد. قسمتهایی از نمونه که به اندازه ی كافی پردازش شده اند در ابتدا مقدار کم تری آبگیری الکل دریافت میکنند اما پاك سازی و شفاف سازی و غوظه وری پارافین مجدد را کامل دریافت خواهند کرد. بخش هایی که پردازش ضعیف داشته اند مراحل فیکساسون، شفاف سازی، آبگیری و غوطه وری بیشتری دریافت میکنند. یک نقطه ضعف بالقوه ی این روش به این دلیل است که باعث آلودگی پارافین پردازنده و محلول های پردازش می شود.

• قبل از پردازش مجدد ، هر بلوک را ذوب کنید ، پارافین اضافی را به آرامی پاک کنید و نمونه ها را در یک تیشوکاست جدید به همراه برچسب قرار دهید. این کار نفوذ معرفهای آماده سازی به نمونه ها را در هنگام پردازش مجدد، بهتر می کند.
• تیشوکاست ها را داخل تیشوبسکت ها قرار داده سپس داخل تیشوپروسسور بگذارید.
• از فرمالین و الکل در یک برنامه ی زمانی دقیق که در آغاز فرآیند برای نمونه مناسب بود استفاده کنید. این میزان به ماهیت نمونه و اندازه ی آن بستگی دارد. . اگر نمونه را در فرمالین نگه دارید و با نمونه های بعدی باهم پردازش کنید راحت تر خواهد بود.

میکروگرافهای تصویر زیر نشان می دهد که با پردازش مجدد با استفاده از محلول 9c (پردازش مجدد مستقیم) می توان به چه نتاجی دست یافت. این حجم نمونه چربی بطور معمول به یک چرخه ی پردازش 8 ساعته برای پردازش بهینه نیاز دارد. اما عمدا تحت یک چرخه ی ناکافی 2 ساعته پردازش شده است. تصویر زیر بهترین برشی را نشان می دهد که می توان پس از این چرخه ی 2 ساعته بدست آورد. تصویر زیر نیز پس از پردازش مجدد (پردازش مستقیم که در بالا توضیح داده شد)گرفته شده است. که بدنیال چرخه ی 8 ساعته مجددا نمونه به آرامی برش داده شده است.

 

راه حل 9d: پردازش معکوس آهسته

توجه:

پردازش مجدد توسط این روش نسبت به روش های دیگر زمان بیشتری نیاز دارد. اما ملایم ترین و کامل ترین روش در میان روش های ارائه شده همین روش می باشد. این روش  شامل پاک کردن کامل پارافین به آرامی از سطح بافت از طریق ماده شفاف کننده و سپس پاک کردن ماده شفاف سازی با استفاده از الکل و سپس هیدراسیون کامل و مجدد نمونه می باشد. سپس نمونه با استفاده از برنامه ای که در وهله ی اول مناسب بوده است پردازش می شود.

• قبل از پردازش مجدد ، هر بلوک را ذوب کنید ، پارافین اضافی را به آرامی پاک کنید و نمونه ها را در یک تیشوکاست جدید به همراه برچسب قرار دهید. این کار نفوذ معرفهای آماده سازی به نمونه ها را در هنگام پردازش مجدد بهبود می بخشد.
• تیشوکاست ها را داخل تیشوبسکت ها قرار داده سپس داخل تیشوپروسسور بگذارید.
• یک چرخه پردازش معکوس اصلاح شده مانند چرخه نشان داده شده در جدول 3 زیر را اجرا کنید. این کار توسط گزیلل و Waxsol و چندین تغییر الکل ، نمونه را به حالت مطلوب برمیگرداند. برای نمونه های کوچک تر باید از چرخه ی کوتاه تر استفاده شود.

قبل از پردازش مجدد ، نمونه ها به مدت 15 دقیقه در اتانول 70 درصد شستشو داده می شوند.

• از فرمالین و الکل در یک برنامه ی زمانی دقیق که در آغاز فرآیند برای نمونه مناسب بود استفاده کنید. این میزان به ماهیت نمونه و اندازه ی آن بستگی دارد. اگر نمونه را در فرمالین نگه دارید و با نمونه های بعدی باهم پردازش کنید راحت تر خواهد بود.

میکروگرافهای تصویر زیر نشان می دهد که با پردازش مجدد با استفاده از روش 9d (پردازش معکوس آهسته) می توان به چه نتیجه ای دست یافت. این نمونه کبد به طور معمول به یک برنامه 8 ساعته برای پردازش بهینه نیاز دارد. اما عمدا تحت پردازش 2 ساعته کم تر از حد مطلوب قرار گرفته است. تصویر زیر بهترین برشی را نشان می دهد که می توان پس از این چرخه ناکافی بدست آورد.

تصویر دوم پس از پردازش مجدد با استفاده از فرآیند معکوس نشان داده شده، و به دنبال آن یک چرخه 8 ساعته سپس برش مجدد گرفته شده است. اگرچه این برش اکنون منسجم و دارای استاندارد قابل قبولی است اما برخی از آسیبهای ریخت شناسی تولید شده توسط پردازش قبلی همچنان باقی مانده است.

 

راه حل 9e : پردازش معکوس آهسته با مراحل  بازسازی

توجه!

این روش نیاز به زمان بیشتری نسبت به همه ی روش ها دارد اما در شرایطی که رنگ آمیزی نمونه بشدت تحت تاثیر معرف های آلوده قرار گرفته باشد، ارزش زیادی دارد. مانند آلودگی نمونه ها با فرمالین هنگامی که نمونه ها داخل پارافین هستند.(اگر چه آسیب های ریخت شناسی که پردازش اصلی ایجاد کرده است را جبران نمیکند) اما این امکان را فراهم میکند تا برش های منسجم تر و رنگ آمیزی H&E بهتری حاصل شود. این روش مشابه روش 9d در بالا است اما شامل یک مرحله اضافی است. پس از آبرسانی و پیش از پردازش مجدد نمونه ها به مدت 2 ساعت تا یک شب با یک عامل بازسازی کننده مانند محلول BOND ER2 تحت بازسازی قرار می گیرد.(راه حل بازیابی اپیتوپ epitope)، بافر Tris با pH10.2 یا ملایم تر با سالین ایزوتونیک یا  فرمالین بافر شده خنثی10٪ .

این کار عمدتا ائوزینوفیلی طبیعی بافت را دوباره بازسازی می کند.

• تا زمانی که نمونه در اتانول 70% قرار گیرد مانند روش9d در بالا عمل کنید.
• در حجم زیادی از محلول بازسازی در دمای 65 درجه سانتیگراد به مدت 2 ساعت تا یک شب بسته به اندازه و ماهیت آن نمونه قرار دهید.برای نمونه های کوچک در دمای محیط فقط 2 ساعت نیاز است.
• از فرمالین یا الکل مجدداً با استفاده از برنامه ای که در ابتدا برای نمونه مناسب بود استفاده کنید.

تصویر نشان داده شده در شکل زیر با آلودگی عمدی یک نمونه با فرمالین دقیقا قبل از نفوذ پارافین در طول چرخه ی پردازش کافی تولید شده است. “رنگ آبی” و “فروپاشی هسته ای” در این مورد مستقیما نتیجه آلودگی با فرمالین است. این اثر را می توان در بافت با پردازش کم یا در موارد نادر هنگام خطا در عملکرد پردازنده که در آن فرمالین هنگام نفوذ پارافین وارد می شود، مشاهده کرد. شکل بعدی توسط پردازش مجدد نمونه با استفاده از پردازش معکوس آهسته و همراه با یک مرحله بازسازی بدست آمده است. (راه حل 9e با استفاده از BOND Epitope محلول بازیابی 2 pH 9.0) سپس پردازش را ادامه دهید. اگر چه آسیب مورفولوژی در نمونه باقی مانده است اما کیفیت برش ها و رنگ آمیزی بهتر شده است.

 

راه حل 10: بافت با  فیکساسیون ضعیف و پردازش ناقص

توجه!

بافت های بدون فیکساسیون و یا با فیکساسیون ناقص در فرایند پردازش آسیب می بینند. الکل و درجه حرارت بالا اثر فیکساتیو خود را متفاوت با اثر فرمالدهید اعمال می کنند. بافت هایی که بطور کامل تثبیت نشده اند حساس هستند و نسبت به بافت هایی که به طور کامل فیکس شده اند بیشتر مستعد انقباض و سخت شدن می باشند. بنابراین فیکساسیون ضعیف به همراه پردازش ناقص دلیل عمده ی مشکلات و مسائل مرتبط می باشد. به احتمال زیاد پردازش مجدد و ملایم که به همراه برخی اصلاحات اضافی انجام گیرد بهترین عملکرد را در بهبود نتایج خواهد داشت. روش زیر بر اساس روش تاگگارت  که یکی از ملایم ترین تکنیک هایی است که ما توصیف کردیم انجام شده است.

• پیش از پردازش مجدد هر بلوک را بخوبی ذوب کنید، به آرامی پس از ذوب ، پارافین اضافی را از بلوک ها خارج کنید، و نمونه را داخل یک تیشوکاست جدید به همراه برچسب قرار دهید اینکار سرعت نفوذ معرف های شفاف سازی را هنگام پردازش مجدد به داخل بافت بهبود میبخشد.
• کاست ها را در لیوان isotonic saline (محلول آبی 0.9٪ کلرید سدیم) به مدت 1 ساعت در دمای 65 درجه سانتی گراد در دستگاه انکوباتور قرار دهید( 1 ساعت برای طیف وسیعی از انواع نمونه ها و ابعاد مختلف کارآمد است ). اینکار باعث ذوب پارافین و قرار گرفتن پارافین روی سطح saline می شود.
• تیشوکاست ها را از داخل محلول خارج کرده و آن را در فرمالین بافر خنثی 10% برای مدت اضافی قرار دهید. باید به خاطر داشته باشید که ممکن است نمونه تاحدی با فرمالین و الکل هایی که قبلا استفاده شده اند فیکس شده باشد اما ممکن است فیکساسیون اضافی توسط فرمالین فوایدی داشته باشد. که می توان این مرحله را توسط پروسسور اعمال کرد.
• از فرمالین مجدداً در برنامه ای با مدت زمانی که در ابتدا مناسب با ماهیت نمونه بود استفاده کنید. این میزان بستگی به اندازه و ماهیت نمونه دارد.

تصویر نشان داده شده در شکل زیر تصویر لوزالمعده که بطور عمد تحت پردازش ناقص و فیکساسیون ضعیف قرار گرفته است را نشان می دهد. برش بلوک بسیار دشوار بوده و قسمت هایی از نواحی مرکزی آن به کلی از بین رفته است. بخش های سالم بافت نیز مورفولوژی سلولی بسیار ضعیفی را نشان میدهد که هسته ها فاقد جزئیات هستند. (ذوب هسته ای) همچنین دارای ظاهری با رنگ آبی روشن می باشد.بافت از نظر سیتوپلاسمی ضعیف بوده و حاشیه سلول به خوبی تعریف نشده است همچنین سلول ها متورم به نظر می رسند. شکل دوم پس از پردازش مجدد به دنبال تکنیک راه حل 10 از نمونه بدست آمده است. روش تارگارت با فیکساسیون بیشتر. اگرچه مورفولوژی بافت نسبت به حالت پیش از بازسازی بهتر از آن است و هاله ی رنگ آبی تا حدی برداشته شده است اما به اندازه ی نتایج بدست آمده در فیکساسیون کامل و پردازش صحیح مطلوب نمی باشد و ترک های سطح بافت و انقباض تا حدی باقی مانده است.