آماده سازی بافت استخوان و دکلسفیکاسیون

• روش اجرایی آماده سازی بافت استخوان:

استخوان نوعی بافت همبند و در واقع سخت ترین نوع بافت همبند است که از اندام های داخلی محافظت کرده و بدن را پشتیبانی میکند . نمونه هایی مانند استخوان و دندان و به طور کلی بافتهایی که دارای رسوبات آهکی هستند باید پیش از فیکساسیون دکلسیفیه شوند تا بتوان آنها را برای مراحل بعد آماده کرد. دکلسیفیکاسیون به معنی آزاد کردن مواد معدنی (کلسیم) از بافت استخوانی بوده و شامل مراحل زیر است:

• تهیه نسوج،

• فیکساسیون،

• دکلسیفیکاسیون،

• خنثی کردن و شستشو با آب.

از استخوان دکلسیفیه برای مطالعه مغز استخوان به منظور تشخیص تومور و عفونت و سایر اهداف استفاده می شود. اگر ناحیه کلسیفیه در نمونه بافتی قابل توجه باشد، دستیابی به نمونه مطلوب بدون دکلسیفیکاسیون اولیه غیرممکن است.

• محلول دکلسیفیکاسیون باید دارای خصوصیات زیر باشد:
• کلسیم را به طور کلی از بافت ازاد کند.
• به بافت اصلی آسیب نزند.
• در رنگ آمیزی اختلال ایجاد نکند.

استخوان از سلول های استئوسیت، ماتریس کلاژن و کریستالهای هیدروکسی اپاتیت تشکیل شده است که این کریستالها در طی فرایند دکلسیفیکاسیون حل شده و در صورت صحیح انجام شدن باید بعد از اتمام فرایند دکلسیفیکاسیون نمونه بافت استخوان از لحاظ فیزیکی مشابه بافت پیوندی فیبروز چگال باشد.

توجه:

مدت زمان لازم برای دکلسینه کردن به نوع نمونه بستگی دارد اگر نمونه مورد نظر مغز استخوان باشد مدت زمان لازم یک ساعت بوده و یا اگر نمونه فمور باشد مدت زمان لازم یک ماه است. افزایش دما به فرایند سرعت می بخشد اما ممکن است به بافت اسیب برساند بنابراین باید احتیاط شود.

توجه:

علاوه بر استخوان سایر بافتها نیز مانند دیواره در رگهای خونی و یا در کلیه و شش نیز میتوانند کلسینه شده و نیاز به عملیات دکلسیفیکاسیون قبل از پروسه اماده سازی بافت برای برش داشته باشند.  برای نرم نمودن بافت استخوان نیمه سخت، میتوان آنرا در اسید استیک 10%قرار داد و به منظور نرم کردن بافت استخوان خیلی سخت میتوان آن را در اسید نیتریک 10% قرار داد

توجه:

بهتر است قطاع 2.5 میلی متری از بافت تهیه شود.

توجه:

ماهیت نمونه دریافت شده مهم است و باید مورد توجه قرار گیرد چرا که برای تعیین زمان لازم برای دکلسیفیکاسیون و فرایند، میزان استخوان اسفنجی و فشرده نمونه حائز اهمیت است.

  تعیین نقطه پایان فرایند دکلسیفیکاسیون:

برای دستیابی به نتایج با کیفیت بالا تعیین نقطه ای که تمام کلسیم بافت خارج می شود مهم است زیرا ادامه بیش از حد فرایند به دلیل استفاده از اسیدهای قوی موجب اسیب دیدگی بافت و عدم تکمیل فرایند موجب عدم توانایی در برش بافت میشود. بهترین روش به خصوص برای نمونه های بزرگ مثل استخوان فمور، استفاده از انالیز X-Ray است. این انالیز کوچکترین کلسیم موجود را نیز مشخص می کند. تست شیمیایی تعیین وجود کلسیم استفاده از امونیوم اگزالات است اگر کلسیم اگزالات تشکیل شود نشان دهنده لزوم ادامه یافتن فرایند دکلسیفیکاسیون می باشد. تست فیزیکی شامل خم کردن و دستکاری نمونه نیز میتواند استفاده شود البته نتایج این تست نمیتوانند قابل اعتماد باشند و میتوانند موجب اسیب دیدگی نمونه نیز بشوند.

شکل1: مقطع عرضی از استخوان دکلسیفیه شده و رنگ امیزی شده توسط H&E

شکل2 : مقطع دکلسیفیه شده از استخوان اسفنجی (صورتی) و غضروف هیالین (آبی)

مقطع پودری استخوان:

اما در صورتیکه یک نارسایی استخوان متابولیکی مورد بررسی قرار گیرد و نیاز به تمایز استخوان معدنی (mineralized bone) از استئوید (osteoid) باشد و یا اندازه گیری های مورفولوژیک استخوان مد نظر باشد لازم است که قسمت معدنی استخوان حفظ گردد. و برش از استخوان کلسیفیه صورت گیرد چون استخوان معدنی یک بافت بسیار سخت است روش های محدودی برای تهیه برش از آن وجود دارد. می توان بعد از فیکساسیون انرا به طور مستقیم بر روی یک صفحه سیلیکونی پهن کرد و توسط سطوح خشن آن را پودر نمود و مقطع پودری نازک مانند شکل 6 تهیه نمود. یک راه حل دیگر آن است که نمونه های استخوان را از طریق آغشته سازی با رزین های آکریلیک یا اپوکسی تهیه کنیم تا بعد از پلیمریزاسیون، سختی مشابه با استخوان معدنی پیدا کنند سپس میتوان برش هایی از نمونه اغشته شده را توسط میکروتوم های سنگین با تیغه هایی از جنس تنگستن-کاربید یا الماس مانند شکل 3 تهیه نمود.

شکل 3: یک مقطع پودر شده بدون رنگ آمیزی از استخوان فشرده همانطور که مشاهده میشود تعدادی از استئون ها (سیستم هاورس) به صورت عرضی بریده شده اند استئون ها شامل لایه های متحدالمرکز استخوان هستند که اطراف کانال هاورس شامل عروق خونی قرار گرفته اند داخل این لایه های استخوانی فضاهایی وجود دارد که شامل استئوسیت هستند. در مقطع های پودری خشک شده مانند شکل انها توسط ساختارهای سیاه رنگ مشخص شده اند.

شکل 4: یک نمونه بدون دکلسیفیکاسیون از استخوان اسفنجی. استخوان در فرمالین فیکس شده و توسط رزین اپوکسی آغشته شده است استخوان کلسیفیه به رنگ سیاه مشخص شده و استئویدها بر روی استخوان تراباکولار به رنگ ابی رنگ امیزی شده اند. مشاهده میکنیم که علی رغم حمایت رزین اپوکسی، ماتریس کلسیفیه هنگام تهیه برش ترک برداشته است.

برای مشاهده مقاله ی قالبگیری بافت با پارافین (امبدینگ) روی دکمه زیر کلیک کنید.