رنگ آمیزی اختصاصی بافت

رنگ آمیزی اختصاصی

رنگ آمیزی اختصاصی بافت

در بافت شناسی از روش های مختلفی برای رنگ آمیزی بافت استفاده میشود.

تشخیص بین سلولهای مختلف بافت هنگام مشاهده یک نمونه در زیر میکروسکوپ نوری ، اغلب دشوار است ، زیرا این سلول ها تقریباً بی رنگ هستند. بنابراین برای ایجاد تمایز در رنگ ها، مشاهده و تجزیه و تحلیل واضح تر سلول ها از رنگ آمیزی بافت نمونه استفاده می شود.

رنگ آمیزی به طور گسترده ای در هیستوپاتولوژی و تشخیص استفاده می شود ، زیرا شناسایی ناهنجاری ها در تعداد سلول و ساختار زیر میکروسکوپ را امکان پذیر می کند. طیف وسیعی از روش های رنگ آمیزی، از رنگ ها و فلزات گرفته تا آنتی بادی های برچسب خورده ، در بافت شناسی استفاده می شود.

برای رنگ آمیزی ، به طور معمول از بخش های پارافینی بافت استفاده می شود. آنها دوباره آب رسانی شده و سپس با استفاده از ماده پاک کننده )شفاف کننده) مانند گزیلل ، قبل از رنگ آمیزی ، شفاف سازی می شوند. در این مقاله رایج ترین رنگ آمیزی های استفاده شده در بافت شناسی بیان شده است.

تفاوت رنگ آمیزی عمومی و اختصاصی

رنگ آمیزی اختصاصی

هماتوکسیلین و ائوزین( H&E ): رنگ آمیزی روتین و عمومی

این رایج ترین روش رنگ آمیزی در بافت شناسی است که برای افتراق ساختارهای مختلف بافت استفاده می شود. همچنین نقش مهمی در تشخیص انواع آسیب ها دارد. هماتوکسیلین ، رنگی است که به طور طبیعی در چوب درخت لانگ وود در آمریکای مرکزی یافت می شود. در روش H&E از مخلوط هماتوکسیلین اکسید شده معروف به هماتئین استفاده می شود. به دلیل میل ضعیف هماتین به پیوند با بافت ها ، ماده ثابت کننده رنگی در رنگ آمیزیH&E  گنجانده می شود. معمولاً بیشترین ماده ثابت کننده ای که برای این منظور استفاده میشود نمک های آلومینیوم ، آهن و تنگستن هستد.که این ماده به همالوم معروف است. هنگامی که روی قسمت بافتی قرار می گیرد ، همالوم هسته های آبی را لکه دار می کند. سپس نمونه با استفاده از محلول ائوزین (الکل یا آب) که پروتئین ها و سیتوپلاسم ها را با سایه های مختلف صورتی رنگ آمیزی می کند ، کم رنگ می شود. ائوزین یک نوع ترکیب شیمیایی (رنگ Xanthene) است و انواع مختلفی دارد اما به طور کلی معمولا از ائوزین Y استفاده می شود.

رنگ آمیزی H&E
رنگ آمیزی عمومیH&E در بافت پیوندی سست شده (اسلاید بافتی)

روش کلی رنگ آمیزی H&E به شرح زیر است :

  • نمونه دوباره آب رسانی شده و سپس با استفاده از گزیلل پاکسازی و شفاف می شود. سپس در هماتوکیسلین غوطه ور می شود که زمان این غوطه وری باتوجه به نوع رنگ و ترجیهات شخصی متفاوت در نظر گرفته میشود..
  • در اینجا 2 گزینه بالقوه وجود دارد – پیشرونده یا پسرونده.روش پسرونده شامل رنگ آمیزی زیاد نمونه ( اشباعی) ، و سپس شستشوی رنگ اضافی است. پیشرونده شامل استفاده از رنگ با غلظت کمتر و بررسی آن در فواصل زمانی است که بخش به حد کافی آغشته شود.
  • نمونه بافت در آب لوله کشی شستشو داده شده و سپس در یک محلول اسید – الکل غوطه ور می شود.
  • در آب لوله کشی غوطه ور میشود.
  • در رنگ ائوزین غوطه ور میشود.
  • رنگ های اضافی با آب شستشو داده میشوند.
  • بافت با اتانول آبگیری میشود و با استفاده از یک ماده زرینی (چسب مخصوص) نصب می شود.

رنگ آمیزی اختصاصی

از رنگ آمیزی های مخصوص برای شناسایی و نشان دادن ساختارها و بافتهای خاصی استفاده می شود که توسط رنگ آمیزی H&E قابل مشاهده نیستند. انواع مختلفی از روش ها و رنگ ها وجود دارد ، جزئیات مختصر برخی از آنها در زیر آورده شده است.

Van Gieson

رنگ آمیزی Van Gieson  یک رنگ آمیزی بسیار رایج است که برای برجسته کردن تفاوت بین کلاژن و سایر بافت های همبند مانند بافت ماهیچه استفاده می شود. از این روش اغلب برای شناسایی ترتیب مشخصه الیاف فیبر در انواع مختلف تومور استفاده می شود. این رنگ آمیزی از مخلوط اسید پیکریک و اسید فوکسین برای نفوذ به نمونه بافت استفاده می کند و باعث قرمز شدن کلاژن می شود. بافت های ماهیچه ای اطراف سلول های خونی به رنگ زرد رنگ آمیزی شده اند.

مولکول های اسید پیکریک بسیار کوچک هستند ، بنابراین به انواع بافت ها نفوذ می کنند. با این حال ، آنها فقط در گلبول های قرمز و بافت ماهیچه کاملاً حفظ می شوند ، زیرا بافت نزدیک به یکدیگر دارند. این باعث می شود که کلاژن متفاوت از بافت ماهیچه و گلبول های قرمز خون رنگ آمیزی شود و باعث تمایز آن شود. امروزه ، ماده ای به نام ponceau S (ترکیب شیمایی)اغلب به عنوان جایگزین اسید فوکسین استفاده می شود ، زیرا کارآمدتر است.

رنگ آمیزی Van Gieson
رنگ آمیزی Van Gieson

مراحل انجام روش Van Gieson  به شرح زیر است:

نمونه با استفاده از گزیلل مجددا آبرسانی میشود.

نمونه با رنگ آمیزی توالی ترتیب سلستین بلو-هماتوکسیلین رنگ آمیزی می شود.

مقدار اضافی با استفاده از آب شسته می شود.

نمونه به مدت 1-5 دقیقه در داخل رنگ Gieson Van غوطه ور می شود.

سپس مجددا نمونه را با آب مقطر شستشو می دهیم.

سپس با اتانول آبگیری و با گزیلل شفاف سازی میکنیم.

نمونه را بااستفاده از ماده ی زرینی (چسب مخصوص)میچسبانیم.

Toluidine blue

Toluidine blue که گاهی اوقات به عنوان کلرید تولونیوم شناخته می شود ، نوعی رنگ متاکروماتیک است که اسیدوفیل است ، به این معنی که بافت های اسیدی را لکه دار می کند . این ماده بطور خاص جذب اسیدهای نوکلئیک می شود و بنابراین برای رنگ آمیزی بافت های غلیظ DNA و RNA استفاده می شود. در تماس با Toluidine blue ، اسیدهای نوکلئیک به رنگ آبی در می آیند ، در حالی که مخاط و غضروف بنفش می شوند. برای شناسایی گرانولهای (زیردانه های) سلولهای ماسِت Macet cells(ماستوسیت یا لابروست نیز نام دارد) ، مخاط و غضروف استفاده می شود.

روش اصلی رنگ آمیزی Toluidine blue به شرح  زیر است:

  • بافت نمونه با استفاده از آب مقطر هیدارته میشود.
  • بافت برای چند دقیقه در Toluidine Blue غوطه ور می شود.
  • مقدار اضافی با آب مقطر شسته می شود.
  • سپس با استفاده از الکل دهیدراته و با گزیلل شفاف می شود.
  • سپس نمونه با استفاده از یک ماده رزینی (چسب مخصوص) نصب میشود.

 

رنگ آمیزی Toluidine blue
رنگ آمیزی Toluidine blue غضروف نای ( اسلاید بافت شناسی)

Alcian blue

رنگ Alcian blue یکی از رنگهای آلسیایی است که در سال 1948 معرفی شد. سایر رنگهای آلسیان شامل زرد آلسیان و سبز آلسیایی است. این خانواده از رنگهای اساسی چند ظرفیتی است که حاوی 2-4 گروه ایزوتیورونیوم دارای بار مثبت است.

آلسیان آبی یک رنگ فتالوسیانین است که خاصیت آن را برای موادی مانند گلیکوزآمینو گلیکان ها و موسین های اسیدی نشان می دهد برای توصیف و دسته بندی زیرگروههای موسن های اسیدی ، pH محلول آلسیان آبی متنوع و قابل تنظیم است.

Alcian blue باعث  می شود که موسین های اسیدی و مواد مخاطی به رنگ آبی در بیایند و هسته ها هنگام استفاده از رنگ قرمز خنثی برای زیرلایه ی رنگ ، صورتی مایل به قرمز به نظر برسند.رنگهای آلسیان آبی محلول در آب هستند ، و چون حاوی مس هستند به رنگ آبی به نظر می رسند. آنها به سولفات و اسید کربوکسیله موکوپلی ساکاریدها و گلیکوپروتئین ها متصل می شوند و اتصال رنگ کاملا الکترواستاتیک است.

رنگ آمیزی alcian blue
برجسته سازی سلول های جامی مری بارت توسط رنگ آمیزی Alcian blue

این رنگ آمیزی برای دیدن تخریب موکوئید و شناسایی موسن های اسیدی که توسط تومورهای مختلف بافت همبند و اپیتلیال آزاد می شوند ، انجام می شود. روش رنگ آمیزی معمولاً به شرح زیر انجام می شود:

  • ابتدا نمونه با آب مقطر هیدراته میشود.
  • در Alcian blue غوطه ور میشود ( زمان غوطه وری میتواند بنا به شرایط متفاوت باشد)
  • بافت را با آب لوله کشی پاک سازی می کنیم سپس مجددا با آب مقطر شستشو میدهیم .
  • رنگ قرمز هسته ای به عنوان زیر لایه ی رنگ به مدت 5 دقیقه به آن اضافه می شود.
  • با الکل دهیدراته و با گزیلل شفاف میشود.
  • سپس با استفاده از یک ماده رزینی چسب می شود.

Giemsa

این روش استفاده از یک لکه رنگ خون است که می تواند از نظر هیستوپاتولوژی استفاده شود. این ماده در اصل برای نشان دادن انگلهای مالاریا طراحی شده بود. اما بعدها به دلیل قابلیت رنگ آمیزی با کیفیت بالا در غشا سلول های کروماتین و هسته ای ، در بافت شناسی مورد استفاده قرار گرفت. این ماده سلولهای انسانی را با سلول های متاژنیک و بیماری زا به طور متفاوتی لکه دار می کند ، بنابراین در تشخیص بسیاری از بیماری ها استفاده می شود زیرا سلول های انسانی را به رنگ بنفش و سلول های باکتریایی را به رنگ صورتی لکه دار می کند ، به همین دلیل می توانند از یکدیگر تشخیص داده شوند. این ماده همچنین برای لکه دار کردن سلولهای خونی استفاده می شود ، به طوری که ممکن است ترکیب و ساختار آنها مشاهده شود

روش رنگ آمیزی به شرح زیر است:

 

Nissl

از رنگ آمیزی Nissl برای نمایان کردن مواد Nissl (توده هایی از شبکه آندوپلاسمی خشن و پلی ریبوزوم های آزاد) که در سلول های عصبی یافت می شود ، استفاده می شود. این روش سلولهای عصبی را از  gliaمتمایز می کند و می توان با کمک این رنگ ، ساختار معماری سلولهای عصبی را به خوبی بررسی کرد. از بین رفتن ماده Nissl می تواند بیانگر ناهنجاری هایی مانند آسیب سلول یا تحلیل رفتن باشد که به نوبه خود می تواند بیماری را مشخص کند.

رنگ آمیزی Nissl
رنگ آمیزی مواد Nissl توسط روش رنگ آمیزی Nissl                                             (اسلاید بافت شناسی)

رنگی که معمولاً در این روش استفاده می شود Cresyl Echt Violet Acetate نام دارد که در محلول با آب مقطر مخلوط می شود. این ماده نیسل را به رنگ آبی تیره یا بنفش تیره رنگ آمیزی می کند.

روش رنگ آمیزی Nissile به شرح زیر است:

(PAS)  Periodic acid-Schiff

این روش یک نوع رنگ آمیزی مخصوص بافت شناسی است که برای علامت گذاری کربوهیدرات ها (گلیکوژن ، گلیکوپروتئین ، پروتئوگلیکان ها) استفاده می شود .PAS معمولاً در بافت کبدی که در آن رسوبات گلیکوژن ایجاد می شود ، استفاده می شود که در تلاش برای تشخیص انواع مختلف بیماریهای ذخیره سازی گلیکوژن انجام می شود. PAS  از آن جهت مهم است که می تواند گرانولهای گلیکوژن موجود در تومورهای تخمدان و سیستم غدد درون ریز در لوزالمعده،  همچنین در مثانه و سیستم کلیوی را تشخیص دهد. همچنین در رنگ آمیزی PAS غشا زیرین نیز می تواند ظاهر شود که هنگام تشخیص بیماری کلیوی مهم است. با توجه به حجم بالای کربوهیدرات ها در دیواره سلولی هیف (( Hyphaeو مخمرهای قارچ ها ، رنگ آمیزی Periodic acid -Schiff می تواند به مکان یابی این گونه در داخل نمونه های بافتی بدن انسان کمک کند.

رنگ آمیزی PAS
کاندیدیازیس مری ، رنگ آمیزی PAS

 

Orcein

از رنگ اورسئین برای شناسایی اجسام انکلوزیونی ویروس ها استفاده می شود. این ذرات ویروسی درون سلولهای انسانی هستند و برخلاف خود ویروس ها با استفاده از میکروسکوپ نوری قابل مشاهده هستند.از رنگ Orcein معمولاً برای تشخیص هپاتیت B استفاده می شود که باعث تشکیل اجسام انکلزیون در سلولهای کبدی بدن می شود. Orcein از مخلوطی از ترکیبات آمینو و هیدروکسی فنوکسازون تشکیل شده است. نتیجه رنگ این است که اجسام  درگیر انکلزیونی به رنگ قهوه ای-بنفش تیره رنگ آمیزی می شوند. پروتئین های مرتبط با مس نیز به رنگ بنفش تیره رنگ می شوند. در این روش از محلول Orcein همراه با 70٪ اتانول و اسید کلریدریک استفاده می شود.

رنگ آمیزی Orcein
رنگ Orcein لامل های الاستیک (اسلاید بافت شناسی)

روند انجام رنگ آمیزی  Orcein به شرح زیر است:

  • نمونه با استفاده از آب مقطر هیدراته می شود.
  • به مدت 10 دقیقه در محلول پرمنگنات پتاسیم قرار دهید.
  • در آب بشویید.
  • در اسید اگزالیک 5٪ غوطه ور کنید تا بی رنگ شود.
  • با آب لوله کشی شستشو دهید.
  • سپس 5/0٪ اسید پریودیک اضافه کنید
  • سپس آن را با آب لوله کشی و بعد با آب مقطر شستشو دهید.
  • سپس نمونه باید بین 4 تا 16 ساعت در دمای اتاق در محلول Orcein غوطه ور بماند.
  • در اتانول شستشو دهید.
  • سپس با اتانول دهیدراته و با گزیلل شفاف سازی شود.
  • سپس با استفاده از ماده ی رزینی چسبیده میی شود.

 روش رنگ آمیزیGomori’s Reticulin Fiber

 روش رنگ آمیزیGomori's Reticulin Fiber
رنگ آمیزیGomori’s Reticulin Fiber

نکاتی برای انجام بهتر رنگ آمیزی اختصاصی:

  • روش رنگ آمیزی را کاملا درک کنید.
  • مشخص کنید که با روش رنگ آمیزی که اجرا می کنید می خواهید دقیقا چه چیزی را نشان دهید. فقط “پیروی از روش” و ً واقف نبودن به هدف نهایی، منجر به نتایج ضعیف خواهد شد.
  • از روش های کنترلی استفاده کنید.همیشه از یک اسلاید کنترلی استفاده کنید که مشخصاً حاوی ساختار / ماده ای است که می خواهید نشان دهید.
  • از زمانبندی دقیق و مناسب استفاده کنید. البته زمانبندی همیشه مقداری تقریبی است اما زمانبندی نادرست نتایج متناقض به همراه خواهد داشت.
رنگ آمیزی اختصاصی
هردوی این برش های پوست از بلوک یکسان ، با روش PAS رنگ آمیزی شده اند. بخشA به مدت 5 دقیقه در پریودیک اسید غوطه ور مانده است )مرحله اکسیداسیون) ولی بخش B فقط مدت 30 ثانیه زمان داشته است (نادرست) . توجه داشته باشید که در برش B به عنوان نتیجه، غشا زیرین بسیار ضعیف رنگ آمیزی شده است. 
  • پایداری معرف را در نظر بگیرید. از ماندگاری معرف هایی که استفاده میکنید آگاه باشید. برخی از معرف ها یا محلول های رنگ به کندی کیفیت خود را از دست میدهند در صورتی که برخی دیگر بسیار ناپایدار بوده و باید بلافاصله استفاده شوند. برخی نیز پیش از مصرف باید مدتی باقی بمانند تا اکسیده شوند سپس مورد استفاده قرار گیرند.
  • بر اساس دستورالعمل پیش بروید و پروتکل ها را دقیقا دنبال کنید.
  • هرگونه تغییر را ثبت کنید و سعی کنید تا خروجی های روشی را که استفاده می کنید مستند سازی کنید. گاهی بدلیل عدم ثبت خروجی ها، هنگام بدست آمدن نتایج نامطلوب، پیدا کردن دلیل آن بسیار دشوار تر و غیر ممکن است.
رتیکولین
در این رنگ آمیزی آغشته به نقره برای رتیکولین ، الیاف ضعیف نشان داده می شوند و یک لکه پس زمینه (رسوب) روی لام وجود دارد. اگر روش عیناٌ رعایت نشود تعیین علت چنین مشکلی بسیار دشوار است (روش Gordon & Sweets ، کلیه)
  • از فیکساسیون صحیح نمونه اطمینان حاصل کنید، فیکساسیون کامل با استفاده از شرایط ثابت و شناخته شده (نوع فیکساتور ، pH ، دما ، زمان) بهترین نتایج را به همراه دارد. نمونه ها باید قبل از پردازش بررسی شوند تا مشخص شود آیا به تثبیت بیشتری نیاز است یا خیر.
رنگ آمیزی بافت
فیکساسیون ناهموار (تثبیت ناحیه ای) باعث رنگ آمیزی ناهموار در این نمونه شده است (تومور پستان ER,)
  • مراحل شستشو را استاندارد سازی کنید و نسبت به مراحل شستشو دقت ویژه ای داشته باشید چرا که علت بیشتر ننایج متغییر ، در این مرحله اتفاق می افتند.
رنگ آمیزی اختصاصی
این برش ها با روش یکسان رنگ آمیزی شده اند و تنها تفاوت آنها در روش شستشوی آنها است. الیاف رتیکولین سیاه هستند و در برش A واضح تر مشخص می شوند. (روش Gordon & Sweets)

 

 

 

 

روش های دیگر رنگ آمیزی اختصاصی و عمومی بافت را از لینک زیر مطالعه کنید.

کلیک کنید!

 

 

 

منابع

https://en.wikipedia.org/wiki/Staining

3 دیدگاه برای “رنگ آمیزی اختصاصی بافت

  1. اشتراک‌ها: برش بافت نمونه یا grossing - دید سبز - مقالات - برش بافت نمونه یا grossing

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *