بافت مغز

بافت مغز

محققان علوم اعصاب معمولاً برای تعیین مکان جزئیات مغزی که زیر میکروسکوپ مشاهده می کنند، نیاز به دیدن برش هایی از کل مغز
دارند. مغز باید سخت شود تا بتوان مقاطع نازک را برش داد، مگر اینکه از میکروتوم تیغه ارتعاشی که بسیار کندتر است استفاده شود.
قالبگیری پارافین که معمولاً برای نمونه های پزشکی استفاده می شود فقط برای نمونه های کوچک یا نازک مناسب است، بدلیل بزرگی
بافت مغز پارافین به مرکز کل مغز جوندگان نفوذ نمی کند. بنابراین، محققان علوم اعصاب معمولا از انجماد برای سخت کردن بافت مغز
برای برش استفاده می کنند.
تصویربرداری از نمونه های بافتی امکان تشخیص و شناسایی ناهنجاری ها را فراهم می کند. در یک محیط تحقیقاتی، این امر درک
فرآیندهای بیماری را بیشتر می کند که امکان توسعه درمان های جدید برای جبران یا اصلاح ناهنجاری را فراهم می کند.
بافت شناسی مغز، به دلایل واضح، یک ابزار تحقیقاتی است تا یک ابزار بالینی. با این حال، همچنان بسیار موضوع ارزشمندی است، زیرا
بافت مغزی حاصل از مغزهای اهدایی می تواند بینش های مهمی را در مورد آسیب شناسی زمینه ای بیماری هایی مانند آلزایمر ارائه دهد که میتواند به توسعه درمان ها برای بیماران آینده کمک کند.
بنابراین دسترسی به داده های بافت شناسی بسیار دقیق برای پیشرفت تحقیقات و نتایج درمان حائز اهمیت است. به دست آوردن چنین
داده هایی نیاز به برشهای بافت شناسی با کیفیت بالا و پردازش بافت شناسی بصورت دقیق و قابل اعتماد دارد. هر مرحله از فرآیند نمونه
برداری و آماده سازی باید به خوبی انجام شود تا اطلاعات ارزشمندی از تصویربرداری به دست آید.

در نوروبیولوژی، به دست آوردن تصاویر مورد نیاز می تواند چالش برانگیز باشد. بخش های تصویربرداری بافت شناسی معمولاً کمتر از یک
سلول ضخامت دارند، اما تحقیقات عصبی-بیولوژیکی اغلب به ارزیابی ارتباطات بین سلول ها و بین مناطق مختلف مغز نیاز دارند.

برای اینکه بتوان ساختار زیر سلولی را با سازماندهی مدارهای عصبی مرتبط کرد، باید حجم بافت بزرگ تری با وضوح بالا تجسم شود. با
521 میلی متر مغز، چالش های بیشتری را برای آماده سازی برش های بافت کامل برای تصویربرداری ایجاد می کند. این مقاله × ابعاد 571
چالش های منحصر به فرد آماده سازی بافت فیزیکی با ابعاد بزرگ برای تصویربرداری را بازگو میکند.

فیکساسیون

تثبیت بافت نمونه در حالتی که ویژگی های بافت زنده تا حد امکان حفظ شود لازم است. بنابراین تثبیت باید در اسرع وقت پس از نمونه
برداری و جراحی بافت ها انجام شود. طیف وسیعی از فیکساتورها در دسترس هستند و اگرچه هیچ کدام کامل نیستند، اما بطور کلی
فرمالدئید به عنوان فیکساتور انتخابی در نظر گرفته می شود. همچنین میدانیم که فرمالین به خوبی به بافت نفوذ می کند، اما این کار را
به آرامی انجام می دهد و این می تواند به معنای انتظار طولانی در هنگام استفاده از نمونه های بزرگ مانند مغز باشد.
آماده سازی اولیه دقیق هر بخش برای اطمینان از حفظ نمونه حیاتی است. به ویژه برای نمونه های با حجم بزرگ مانند مغز مهم است که
این مرحله بطورکامل و با زمان مناسب انجام گیرد.همچنین برای اینکار باید حجم کافی فیکساتور نسبت به نمونه مورد استفاده قرار گیرد.
پس از برش و گراسینگ مغز و قرار دادن تکه های بزرگ برش خورده داخل فیکساتیو، یک یا دو روز بیشتر زمان کافی برای نفوذ کامل
فیکساتیو به داخل مرکز بافت اختصاص دهید.

قالبگیری

پس از فیکس کامل بافت ، بافت باید قالبگیری شود تا برش های نازک به طور تمیز توسط میکروتوم بریده شوند. متداول ترین محیطی
که برای بافت مغز استفاده میشود پارافین است. پارافین در دمای حدود 65 تا 65 درجه سانتیگراد ذوب می شود و بنابراین برای
قالبگیری بافت عصبی بی خطر است.
برای جلوگیری از خیس شدن بافت، که برش بافت را دشوار می کند، باید تمام آب از بافت خارج شود و با پارافین جایگزین شود. بافت را
به تدریج با غوطه ور کردن آن در غلظت های متوالی بالاتر الکل، آبگیری کنید.
نکته: استفاده از محلول الکل با ایزوپروپیل برای آبگیری بافت، باعث شکننده شدن بافت مغز میشود پس برای جلوگیری از شکننده شدن
مغز از الکل اتانول استفاده کنید.بهتر است برای جذب بهتر ، محلول و نمونه ها را بطور ملایم هم بزنید. سپس محلول باید با اتانول 58
درصد، اتانول 56 درصد و اتانول 088 درصد در فواصل زمانی 42 ساعته تغییر یابد.
در نهایت، نمونه باید به محلول گزیلل منتقل شود. از آنجایی که پارافین در الکل حل نمی شود، بنابراین این مرحله لازم است تا پارافین
به راحتی در بافت نفوذ کند. برای اطمینان از حذف کامل الکل حداقل دو تغییر گزیلل باید انجام شود تا تمام الکل موجود در بافت حذف
شود.

علاوه بر این، هنگام کار با نمونه های با حجم زیاد مانند مغز، مرحله گزیلل باید گسترش یابد تا از نفوذ خوب اطمینان حاصل شود.
هنگامی که بافت بخوبی شفاف سازی شد پایان دادن به مرحله گزیلل کافی نیست.
نکته: اگر آبگیری بافت بطور کامل و در تمام قسمت های بافت حاصل نشود، این خطر وجود دارد که بافت در حین برش از موم جدا شود
یا بخوبی به لام نچسبد.
سپس میتوان بافت را به موم پارافین ذوب شده منتقل کرد. دو تغییر پارافین در طول 25 ساعت برای نمونه های بافت بزرگتر قبل از
مرحله ی قالبگیری توصیه می شود. استفاده از اجاق خلاء در صورت امکان، نفوذ موم را بسیار افزایش می دهد. سپس می توان بافت و
پارافین را به قالب مناسبی منتقل کرد و صبر کرد تا خنک و جامد شود.
اخیراً امکان جاسازی تا 28 نیمکره مغز موش یا 28 نخاع در یک بلوک با استفاده از فناوری بروز فراهم شده است که به موجب
آن روند تجزیه و تحلیل را تسریع می کند. این امر رنگ آمیزی ثابت در تمام بخش ها را تضمین می کند. با این فناوری میتوان یک نیمکره
ی مغز انسان را در یک بلوک به طور کامل قالبگیری کرد.

برش

پس از سرد شدن بلوک های فرآوری شده میتوان آنها را برش داد. هنگام استفاده از میکروتوم برای تولید مقاطع بزرگ، الکتریسیته ساکن
می تواند یک مشکل واقعی باشد. کارکردن یک مرطوب کننده کوچک نزدیک به میکروتوم لغزشی و نصب آن در ناحیه ای که جریان هوای
کمی وجود دارد، می تواند در به حداقل رساندن این اثرات ناخواسته کمک کند.
نکته: یک ترفند خوب این است که یک حمام آب یخ بزرگ در نزدیکی خود داشته باشید تا قسمت برش داده شده را روی آن شناور کنید
تا زمانی که آماده انتقال به حمام آب گرم برای انتقال روی لام باشند.
میکروتوم رایج ترین ابزاری است که برای تولید مقاطع استفاده می شود، اما ویبراتوم می تواند نتایج بهتری را هنگام برش بخش های
ضخیم تر ارائه دهد. برش بافت کریواستات نیز یک روش گسترده برای برش بافت مغز است.
با این حال، برش کرایوستات معمولی کار فشرده ای است و با خطر آسیب رساندن یا حتی از دست دادن برش ها همراه است.
نکته: برودت با کمک نوار به طور قابل توجهی کیفیت برش ها و سرعت جمع آوری بخش های مغز را بهبود می بخشد.

نصب برش ها روی اسلاید

پیش از قرار دادن بافت ها روی لام ، برشهای بافت باید روی یک حمام آب گرم شناور شوند و لام های شیشه ای روی اسلایدوارمر گرم شوند.گرم شدن برش ها کمک می کند تا اطمینان حاصل شود که بافت صاف است و افزایش انعطاف پذیری به انتقال بافت به لام کمک میکند. برش های بزرگتر مستعد ریزش و متلاشی شدن هستند و بنابراین باید با حرکات آهسته تر و ملایم روی لام شیشه بلند شوند.
رنگ آمیزی رنگ ها در بافت شناسی برای تمایز ویژگی های مورد بررسی استفاده می شوند. طیف وسیعی از رنگ ها با ترکیبات و واکنش های متفاوت در دسترس هستند.
متاسفانه رنگ های پاتولوژی محلول در آب هستند و بنابراین بافت های حاوی پارافین را رنگ آمیزی نمیکنند و لازم است قبل از رنگ آمیزی بافت تمام پارافین از داخل آن خارج شود. این عمل را میتوان با تکرار معکوس شستشو با گزیلل ، الکل و در نهایت آب به دست آورد.

باز هم برای بافت های بزرگتر مانند مغز زمان لازم برای پاک کردن و برداشتن کامل پارافین بیشتر از زمان لازم برای بافت های معمولی و بیوپسی و اکثر پروتکل های استاندارد خواهد بود.
پروتکل های رنگ آمیزی نقره متعددی توسعه یافته اند که هر کدام برای آشکار کردن ویژگی های خاص طراحی شده اند. در هر مورد، ویژگی تعیین شده به رنگ سیاه ظاهر میشوند . روش رنگ آمیزی نقره کمپبل-سوئیتزر که پلاک های عصبی و درهم تنیدگی های پاتولوژی آلزایمر را نشان می دهد، مورد توجه تحقیقات عصب شناسی است.
با بلوک های بافت بزرگ، اطمینان از رنگ آمیزی با کنتراست بالا در سراسر بلوک دشوارتر است زیرا رنگ باید از طریق غشاهای زیادی پخش شود تا به مرکز بلوک برسد. در بافت عصبی، دستیابی به رنگ آمیزی با کنتراست بالا در سراسر نمونه های بافت با حجم زیاد، چالشی اساسی به حساب می آید.

روکش کشی( چسب زنی)

برش رنگ آمیزی شده روی لام باید با یک ورقه پوششی محافظت شود تا از خراشیده شدن بافت محافظت شود و برش بافت از هر گونه آسیبی حفظ گردد. سپس لازم است که یک بار دیگر تمام آب را از سطح برش، با قرار دادن آن در فرآیندی که برای حذف پارافین برای رنگ آمیزی استفاده می شود، خارج کنید. لام رنگ آمیزی شده باید از یک سری محلول الکلی عبور داده شود تا آب از آن خارج شود، سپس قبل از اینکه ماده قالبگیری شده در زیر لام شیشه ای قرارگیرد، از محلول شفاف سازی عبور داده شود. از آنجایی که اسلایدها و روکش های استاندارد برای مقاطع کوچکتر معمولی طراحی شده اند، احتمالاً نیاز به تهیه اسلایدها و روکش های سفارشی مناسب برای قرار دادن نمونه بزرگتر خواهید بود.
لام نهایی باید یک شب در دمای 73 تا 28 درجه سانتیگراد خشک شود و سپس به مدت حداقل 25 ساعت به فر 58 درجه سانتیگراد منتقل شود تا برش ها بخوبی به لام بچسبد.

تصاویر نمونه مغز

References

 Hua Y, et al. Nature Communications 2015; volume 6 article 7923. Available at http://www.nature.com/articles/ncomms8923
 Kapelsohn K. Protocol Exchange 2015.Published online 17 March 2015. Available at http://www.nature.com/protocolexchange/protocols/3745#/procedure
 Pinskiy V. et al. PLOS Published online 16 July 2015. Available at http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0102
 https://www.news-medical.net/whitepaper/20170928/Sectioning-and-staining-large-brain-tissue-for-neuroscience-research.aspx