ایمونوهیستوشیمی IHC

ایمونوهیستوشیمی ( IHC )  چیست؟

ایمونوهیستوشیمی( immunohistochemistry) که به اختصار IHC نیز نامیده می شود ترکیبی از هیستولوژی و ایمونولوژی است. مانند دیگر تکنیک های ایمونولوژی شامل سه بخش مهم است :آنتی بادی ها، سیستم های تولید سیگنال برای ردیابی و فاز جامد که واکنش ها در بستر آن انجام می شود.

این کلمه ممکن است در ابتدا ترسناک به نظر برسد اما اگر آن را به بخش های کوچک تر تقسیم کنید ، مانند “هیستو” ، به معنی بافت و “ایمونو” ، که مربوط به درمان های سیستم ایمنی بدن است ، می توانید درک کلی از این کلمه داشته باشید.

در این روش با استفاده از آنتی بادی که به طور اختصاصی به آنتی ژن متصل می شود می توان وجود یا عدم وجود آنتی ژنی خاص در بافت را بررسی کرد. این اتصال می تواند مستقیم ( یک مرحله ای)  یاغیر مستقیم (دو مرحله ای) باشد.

 

آنتی بادی ها و آنتی ژن ها مانند یک قفل و کلید کار می کنند ،در این سازوکار برای هر قفل خاص ، یک کلید خاص وجود دارد. هنگامی که یک آنتی ژن خاص به بدن شما حمله می کند ، آنتی بادی مربوطه با هدف از بین بردن آن ، به آن متصل می شود ، بنابراین از تولید مثل ، انتشار و آسیب رسانی بیشتر آن، جلوگیری میکند. کشف این حقایق منجر به تعریف مفهوم ایمونوهیستوشیمی می شود ، از آنجاییکه این روش روند طبیعی بدن را در یک محیط آزمایشگاهی تقلید می کند ، به دانشمندان اجازه می دهد آنتی بادی های خاص تولید شده در یک قطعه خاص از بافت اندام را که سیستم ایمنی بدن به طور خودکار برای مبارزه با آنتی ژن های خاص آزاد می کند شناسایی و مطالعه کنند.

با انجام این کار ، محققان می توانند درمان هایی را که به بهترین وجه به یک آنتی ژن خاص پاسخ می دهند و همچنین آنهایی که هیچ تاثیری ندارند ، تعیین کنند ، این امر به ایجاد آنتی بیوتیک های جدید و سایر داروهایی که پاسخ طبیعی بدن به مهاجم را تقلید می کنند، کمک بسزایی میکند.

 

در روش مستقیم، آنتی بادی اختصاصی آنتی ژن بافت به آنزیم متصل است آنزیم ها در مجاورت با سوبسترا تولید رنگ میکنند که در زیر میکروسکوپ نوری قابل مشاهده است. گاهی به جای آنزیم از رنگ استفاده میشود.

در روش غیر مستقیم آنتی بادی اختصاصی آنتی ژن، به بافت متصل شده و بعد از آن آنتی بادی ثانویه را اضافه می کنیم که به آنتی بادی اولیه می چسبد  و از طرف دیگر هم به آنزیم کونژوگه متصل شده است. این کار باعث تقویت رنگ تولید شده توسط سوبسترا می شود.

در آزمایشگاه های تشخیص طبی در بخش پاتولوژی ‍‍‍‍‍‍‍از ایمونوهیستوشیمی به عنوان یکی از راه های اصلی برای بررسی حضور بیومارکرها در بافت به منظور تشخیص سرطان ها مطالعه فرآیند پاتوژنز بیماری‌ها تشخیص ماهیت سلولها و نوع بافت  تعیین اولیه یا متاستاتیک بودن توده موارد پروگنوستیک با اهداف درمانی استفاده می شود. در آزمایشگاه های تحقیقاتی نیز برای بررسی انواع مارکرهای داخل سلولی و خارج سلولی استفاده می شود.

یکی از مزایای این روش این است که امکان مقایسه بین بافت های سالم و بیمار را فراهم می کند ، بنابراین این کاربرد برای دانشمندان و آسیب شناسان بسیار ارزشمند است.

مهمترین مزیت رنگ آمیزی ایمنی ( immunostaining)در ایمونوهیستوشیمی (IHC) توانایی دیدن هدف مورد نظر در یک نمونه بافت با حفظ بافت و ساختار آن است.

انجام فرایند ایمونوهیستوشیمی

ایمونوهیستو شیمی که به آن IHC نیز میگویند ، میتواند در چند مرحله انجام شود. ابتدا بافت و سلولها باید با استفاده از ماده شیمیایی به نام فرمالدئید، فیکس شوند. اینکار ویژگی های ساختاری سلول ها را تثبیت کرده و از تغییر آنها در تمام مراحل جلوگیری میکند. در مرحله ی بعدی سلولها باید با استفاده از مواد شفاف کننده مانند Triton X تحت نفوذ قرار گیرند که به آنتی بادی ها اجازه میدهد وارد بافت شوند و به اپیتوپ های داخل سلول متصل شوند. آنتی بادی های اولیه علیه پروتئین اضافه می شوند و آنتی بادی های ثانویه با آنزیم هایی مانند (horseradish peroxidase (HRP متصل به دامنه ی FC آنها برای هدف قرار دادن آنتی بادی اولیه اضافه میشوند.

آنزیم هایی مانند HRP می توانند مولکول های زیرلایه خاصی مانند دی آمینو بنزیدین (DAB) را هدف قرار دهند و اکسیداسیون را کاتالیز کنند که منجر به ایجاد یک ترکیب با رنگ های متمایز می شود. این ترکیب رنگارنگ در محلی که آنتی بادی مورد هدف قرار گرفته است باقی خواهد ماند و باعث رنگ آمیزی نواحی نزدیک به پروتئین مورد نظر با رنگ متفاوت از بقیه بافت می شود. درنهایت بافت ها توسط رنگی مانند هماتوکسیلین کانتور میشوند تا تضاد بین بافت رنگ آمیزی شده و با استفاده از IHC و مناطق غیر رنگی برای تجسم بهتر ایجاد شود.

هدف ایمونوهیستوشیمی

مهمترین هدف IHC این است که بتوانیم ببینیم که آنتی ژنهای خاص در کدام قسمت نمونه بافتی استفاده می شوند. متمرکز شدن پروتئین ها در نقطه ی خاص برای تشخیص در زمینه هایی مانند سرطان یا بیماری های عفونی مهم است. برای مثال اغلب IHC برای تشخیص نوع خاصی از سرطان پستان استفاده میشود. نمایان شدن بیش از حد گیرنده HER2 واقع در بافت پستان اغلب با رشد و تکثیر سرطان پستان ارتباط دارد. این به این دلیل است که گیرنده های HER2 سیگنال هایی را از فاکتورهای رشد دریافت میکنند. این سیگنال ها منجر به ایجاد یک مسیر انتقال سیگنال درون سلولی میشود که در نهایت منجر به تقسیم و رشد سلول می شود. ایمونوهیستوشیمی می تواند در بررسی میزان قابلیت تشخیص HER2 در نمونه برداری از بافت بسیار مفید باشد.

با هدف قرار دادن گیرنده های HER2 با آنتی بادی ، محلی سازی آنها با رنگ های بستر و تجزیه و تحلیل سطح گیرنده های موجود در بافت ، می توان شواهد بیشتری در مورد وضعیت فعلی بیمار جمع آوری کرد و احتمالاً  انواع خاصی از سرطان را تشخیص داد.

 

 

انواع رنگ آمیزی

رنگ آمیزی ایمنی (immunostaining) میتواند بصورت مستقیم یا غیر مستقیم انجام شود. استفاده از پروتکل های خاص ، برچسب گذاری مستقیم آنتی بادی ها برای تعدادی از فلوروفورها را امکان پذیر میکند. اغلب براساس سطح نمایش آنتی ژن و قابلیت دسترسی آن، یک ترکیب مستقیم برای تجسم و نمایش هدف مورد نظر کافی نیست. در این موارد از برچسب گذاری غیر مستقیم با استفاده از آنتی بادی های ثانویه استفاده می شود. روش ترجیحی استفاده از آشکار سازهای بسیار حساس –یک مرحله ای- مبتنی بر پلیمر، مخصوص IgG  خرگوش یا موش است.

هنگام طراحی آزمون IHC چه متغییر هایی را باید در نظر بگیرید؟

خطوط متقاطع (کراسلینک ها) ایجاد شده در مرحله فیکساسیون می توانند با جلوگیری از دسترسی به آنتی ژن ، از اتصالات آنتی بادی جلوگیری کنند. بنابراین ، معکوس کردن لینک های متقابل با استفاده از روشی به نام بازیابی آنتی ژن بسیار اهمیت دارد.بازیابی آنتی ژن را می توان از طریق روش ناشی از استفاده از گرما یا هضم آنزیمی حاصل کرد.

آنتی بادی اولیه یک جزء مهم در هر روش سنجش IHC است و تأثیر مستقیمی بر کیفیت داده ها دارد. یک آنتی بادی اولیه ی ضعیف یا نادرست، می تواند منجر به نتایج غیر قابل تفسیر یا گمراه کننده شود.

برای تایید یک آنتی بادی جهت استفاده در IHC به بیش از فقط یک رنگ آمیزی موفق در بافت نمونه نیاز داریم؛ برای اطمینان از اینکه آنتی بادی، هدف را به طور دقیق تشخیص می دهد یا خیر ، آنتی بادی مورد نظر باید تحت یک روش تأیید شده و دقیق استفاده شود. استفاده از معرف ها و پروتکل های بهینه برای آنتی بادی می تواند نتایج شما را تا حد زیادی بهبود بخشد. همچنین باید از صحیح بودن سیگنالی که تشخیص می دهید اطمینان حاصل کنید.

دقت کافی در هر آزمایش ، شامل گنجاندن کنترل های مناسب است. کنترل های مثبت و منفی این اطمینان را ایجاد می کنند که آنتی بادی شما، هدف مورد نظر خود را بدرستی تشخیص می دهد.

آماده سازی بافت

روش های جمع آوری ، نگهداری و تثبیت بافت بسته به نمونه یا هدف مورد نظر متفاوت است. جمع آوری و فیکساسیون بافت به طور مستقیم بر یکپارچگی نمونه و نتایج تجربی شما تأثیر می گذارد.

Cross-linking fixative مانند فرمالین، اغلب برای تهیه ی نمونه ها برای IHC استفاده می شوند زیرا یکپارچگی بافت و در نتیجه ساختار بافت را حفظ میکند. گزینه ی دیگر این است که نمونه ها را به صورت منجمد ( cryopreserve) نگهداری کنید که اگر می خواهید نمونه فسفرلیه شده را بررسی کنید گزینه ی بهتری برای اینکار خواهد بود.

 

الگوریتم Aperio Cytoplasm به شما امکان می دهد رنگ آمیزی را با یک نشانگر زیستی پروتئین در داخل سیتوپلاسم سلول ها مدلسازی و اندازه گیری کنید. با استفاده از الگوریتم Aperio Cytoplasm برای تعیین کمیت ناحیه رنگ آمیزی و شدت مارکرهای خاص سیتوپلاسمی ،ضمن اندازه گیری انتقال رنگ آمیزی درون هسته سلول ، برای یک تصویر دقیق از ایمونوهیستوشیمی سلول.

 

 

بازیابی آنتی ژن (Epitope)

مواد فیکساتیوی که برای حفظ یکپارچگی ساختار نمونه استفاده میشود، دارای اشکالاتی هستند زیرا ممکن است اپیتوپ را که آنتی بادی شما برای شناسایی طراحی شده است، دفع کند. روش های مختلفی برای آشکارسازی اپیتوپ هایی که توسط فیکساسیون قابل تشخیص نیستند وجود دارد. این موارد شامل بازیابی آنتی ژن ناشی از پروتئولیتیک است، که به آنزیمی مانند پروتئیناز K متکی است و یا بازیابی اپیتوپ توسط گرما (HEIR) که از گرما برای از بین بردن پیوندها و از بین بردن پروتئین ها استفاده میشود. در هر دو روش می توان اپیتوپ ها را نمایان کرد و آنها را برای آنتی بادی اولیه قابل دسترسی و قابل رنگ آمیزی توسط IHC دانست. با این حال ،دانشمندان چندین روش بازیابی آنتی ژن را آزمایش می کنند تا شرایط بهینه برای استفاده از هر آنتی بادی در IHC را تعیین کنند.

 

انتخاب آنتی بادی برای IHC

همانطور که گفته شد در IHC از آنتی بادی های اولیه و ثانویه استفاده می شود. آنتی بادی های اولیه مستقیما به ژن متصل میشوند، در حالیکه آنتی بادی های ثانویه به آنتی بادی های اولیه متصل می شوند.

هنگام انتخاب آنتی بادی های اولیه برای  IHC، سه نوع آماده سازی آنتی بادی برای  IHC وجود دارد. آنتی بادی های پلی کلونال ، آنتی بادی های مونوکلونال و آنتی بادی های منوکلونال ادغام شده.

آنتی بادی های پلی کلونال با مونوکلونال هر کدام مزایا و معایبی دارند:

• آنتی بادی های پلی کلونال منجر به رنگ آمیزی بیشتر و سیگنال عالی می شوند ، اما می توانند با اتصال سایت های ناخواسته ، فالس پازیتیو ایجاد کند.
• آنتی بادی های مونوکلونال از ویژگی های بالایی برخوردار هستند و تعداد اتصالات فالس پازیتیو را کاهش میدهند اما اغلب رنگ آمیزی ضعیف تری ایجاد میکنند.
• آنتی بادی های مونوکلونال ادغام شده دارای رنگ آمیزی عالی و ویژگی های بالایی هستند با این وجود محدودیت دسترسی برای آنتی بادی های ادغام شده که بدون رقابت متصل نمی شوند وجود دارد.

برای آنتی بادی های ثانیویه ،آنتی بادی باید مقابل گونه ای باشد که آنتی بادی اولیه در آن ساخته شده است. به عنوان مثال اگر آنتی بادی اولیه از خرگوش باشد، آنتی بادی ثانویه باید یک IgG ضد خرگوش باشد که به طور معمول در گونه ی دیگری مانند بز تولید میشود. آنتی بادی های ثانویه نیز با آنزیمی مانند HRP یا بیوتین آمیخته، برای رنگ آمیزی یا تقویت سیگنال، برچسب گذاری می شوند.

IHC  یک روش محبوب برای تجسم در زمینه هایی مانند سرطان ، علوم اعصاب و بیماری های عفونی است.

سیستم های تشخیص

رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی (IHC) امکان شناسایی 2 کلاس گسترده را فراهم می کند: 1) کروموژنیک و 2) فلورسنت. برای تشخیص کروموژنیک ، استفاده از سیستم های مبتنی بر پلیمر را توصیه می کنیم که از محدودیت های سیستم مبتنی بر بیوتین جلوگیری می کند و در عین حال حساسیت روش را افزایش می دهد.

Counterstaining

پس از تشخیص آنتی بادی ، بسیاری از محققان ترجیح میدهند نمونه را برای نمایش آناتومی سلولی Counterstaining کنند و با توجه به رنگ آمیزی اختصاصی نمایش بافت را جهت دهی کنند اینکار باعث تمایز بیشتر رنگ ها و تشخص بهتر میشود. برای مثال میتوانیم توسط هماتوکسلین #14166 که هسته ی سلول را به رنگ آبی تغییر می دهد نمونه را Counterstaining کنیم. هنگام انتخاب روش Counterstaining ،مهم است که Counterstain مورد استفاده ، با کروموژن سازگار باشد. به عنوان مثال ، اگر رنگ Counterstain خیلی شبیه به رنگ کروموژن باشد ، تشخیص سیگنال آنتی بادی مشکل خواهد بود.

 

 

منابع

• https://www.cellsignal.com/common/content/content.jsp?id=resources-protocols
• https://www.cellsignal.com/applications/immunohistochemistry/what-is-immunohistochemistry-staining
• https://www.prosci-inc.com/resources/antibody-development-guide/what-is-immunohistochemistry/
• https://www.geniranlab.ir/%D9%85%D8%B9%D8%B1%D9%81%DB%8C-%D8%AA%DA%A9%D9%86%DB%8C%DA%A9-%D8%A7%DB%8C%D9%85%D9%88%D9%86%D9%88%D9%87%DB%8C%D8%B3%D8%AA%D9%88%D8%B4%DB%8C%D9%85%DB%8C
• https://www.abcam.com/content/immunohistochemistry-the-complete-guide
• https://www.google.com/url?sa=i&url=https%3A%2F%2Fwww.microscopemaster.com%2Fimmunohistochemistry.html&psig=AOvVaw1grIoMumU0JQrRn8AUPuf3&ust=1626757635957000&source=images&cd=vfe&ved=0CAwQjhxqFwoTCNi02_Ou7vECFQAAAAAdAAAAABAK

پرسش های دیدسبز

• در چه مواردی و برای چه نوع بافت هایی از IHC استفاده میکنید؟

• برای انجام این روش با چه مشکلاتی مواجه میشوید؟

• از نظر شما مزایا و معایب این روش چیست؟

* لطفا نظرات خود را با ما به اشتراک بگذارید